Table of Contents

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2023-02-07
   チュートリアル(日本語版)
     ターゲットメソッドの編集
     ターゲットメソッドの最適化
     によるグループ研究データの処理
     既存データ処理および定量実験
     MS1フルスキャンフィルタ
     MS1 フィルタ用 DDA 検索
     併発反応モニタリング(PRM)
     DIA、データ非依存性解析
     SWATHデータの分析
     によるターゲットメタボロミクス解析
     小分子メソッド開発とCE最適化
     小分子の定量化
     絶対定量
     カスタムレポートとライブレポート
     iRT保持時間予測

チュートリアル(日本語版)


[英語] [中国語]

これらのチュートリアルでは,実際のデータを用いた解析をご自身の環境で経験いただくことができます。

入門編

 

フルスキャン測定データの解析

SWATHデータの分析 (35ページ)


小分子タ

小分子ターゲット (12ページ)
小分子の定量化 (28ページ)

 

上級者向け

絶対定量 (21ページ)
iRT保持時間予測 (37ページ)

他の内容は近日公開する予定です!




ターゲットメソッドの編集


ターゲットとするプロテオミクスの実験に適したSkylineドキュメントの作成について学んでいきます。このチュートリアルでは、pepXMLとmzXMLファイルからスペクトルライブラリを作成する方法、そしてFASTAファイルからバックグラウンドプロテオームファイルを作成する方法を学びます。これらの作成したファイルにGPM (Global Proteome Machine) 公開MS/MSスペクトルライブラリを追加することによって、選択された酵母タンパク質やペプチドそしてプロダクトイオンをターゲットするようにSkylineドキュメントを更新する方法も学びます。この作成されたSkylineドキュメントからトランジションリストをエクスポートでき、AB 4000 Q Trapに使うことができます(28ページ)

[ダウンロード]



* - Skyline v0.6にて導入。 v1.4、v2.5、v3.7、v20.1で更新。

2015年2月10日にSkylineチームが作成した ウェビナー#4: Skylineターゲットメソッドデザインでは、この基本的な話題についてもう1つのリソースを紹介します。
[ウェビナー]




ターゲットメソッドの最適化


ここでは、幅広いSRMメソッドで測定されたデータを始め、装置データをインポートし、ドキュメントを最適化することについて学んでいきます。ThermoのTSQでスケジュール化せず、2000を超えるトランジションと39回のインジェクションにより測定した最適化されていないドキュメントから作業を開始していきます。まずは、39回すべてのインジェクション測定データを1つの分析としてインポートする方法を学びます。ペプチドの疎水性度による保持時間予測やMS/MSスペクトルライブラリのピーク強度の相関性を利用して測定するピークの信頼度を高めていきます。Skylineの最適化ダイアログを使用して、最も信頼性のあるピーク以外を除外していきます。このようなステップにより、1回のインジェクションで測定できるようにトランジションのリストを減らしていきます。そして、1回のインジェクションメソッドで複数の繰り返し測定の結果をインポートし確認します。(30ページ)

[ダウンロード]



* - Skyline v0.6にて導入。 v1.4、v2.5、v3.7、v20.1で更新。

私たちのProteomics誌の論文もご覧ください。(こちらを引用下さい)
The development of selected reaction monitoring methods for targeted proteomics via empirical refinement
[要約]


結果の確認やメソッドの最適化については、こちらのASMS2009のポスターもご覧ください。

ASMS 2009 Poster



によるグループ研究データの処理


大規模なデータの解析をSkylineにより効果的に処理する方法を学びます。ここでは、14匹のラットから採取した血漿での健常群と疾患群で検出したターゲットタンパク質の差がきちんと捉えられるようにしていきます。一連のデータを処理することを通じ、短時間でデータ全体を捉え、差を理解ができるSkylineの便利な画面表示を知ることができます。さらに、Skylineのバージョン21.2で導入された、Skylineによる群間の差の比較方法についても経験できます。 (73 ページ)  下書き

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* - Skyline v3.1, 21.2 にて導入。




既存データ処理および定量実験


ここでは、公開されているSRMのトランジッションのリストと質量分析装置の測定データを用いて、Skylineにより安定同位体標識された内標準ペプチドを利用した定量分析について体験していきます。Skylineのピークエリアと保持時間のサマリーチャートを活用することで、あなた自身のデータを効果的に分析する方法を学びます。(44ページ)

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* - Skyline v0.7より導入。 v1.4、v20.1にて更新。(ドラフト版)




MS1フルスキャンフィルタ


ここでは、data dependent 測定(DDA)の実験でのMS1スキャンデータを使用して、ペプチドの発現量の差を測定するSkylineドキュメントの作成方法について体験していきます。このチュートリアルでは、まず、探索的な実験のデータ(discovery data)からスペクトルライブラリを構築します。 そして、SkylineドキュメントをMS1フィルタリング用に設定します。 次に、測定したMS1スキャンデータからプリカーサーイオンのクロマトグラムを抽出するために質量分析装置で測定した生のデータをインポートします。 クロマトグラム上の目的のピーク選択については、MS/MSによるペプチド同定情報に基づき行われ、さらにSkyline上での処理を行うことで定量テータを得ることができます。探索実験のデータを用いた標識のない定量分析に興味がある場合、このチュートリアルは研究の新しいツールとなるでしょう。41ページ)

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* - Skyline v1.2より導入。 v1.4、v2.5、v20.1、v21.1にて更新。

2014年10月21日にSkylineチームが作成したウェビナー#1: SkylineによるDDAデータの活用は、SkylineでDDAデータを扱う上で役に立つリソースです。
[ウェビナー1]

2015年6月16日にSkylineチームが作成したウェビナー#8: ターゲットのDDA: Skylineの差別化統計は、DDA実験で検出された全ペプチドから開始して、検体内で変化が見えるタンパク質へと減らすターゲットを絞らない方法です。
[ウェビナー8]

2015年9月29日にSkylineチームが作成したウェビナー#10: Skylineの修飾の作業は、ペプチド修飾についての詳しい説明に加えて、PTMのインポート、同位体標識、大規模なアッセイライブラリのインポートなどの話題を扱います。
[ウェビナー10]

クロマトグラムでID注釈の表示に関する問題が生じた場合は、ヒント: Mascot検索結果でID注釈が表示されない場合を確認してください。Mascotを使用しない場合でも役立つ情報が記載されています。
[ヒント]

私たちのMolecular Cellular Proteomics誌の論文もご覧ください。(こちらを引用下さい)
Platform independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline. Application to protein acetylation and phosphorylation
[要約]




MS1 フィルタ用 DDA 検索


ここでは、data dependent 測定(DDA)DDA質量分析計ファイルの開始、MS Amandaを使ったペプチド検索の実行、検索結果からのスペクトルライブラリの構築、そしてDDAファイル内のMS1スペクトルから定量分析のクロマトグラムを抽出する実務経験を積んでいきます。本チュートリアルでは、Skylineのペプチド検索ウィザードを使用し、安定同位体標識タンパク質をスパイクしたシグマアルドリッチUPS1標準混合品を使ってヒト全血細胞溶解物から取得した3つのDDAデータファイルを検索します。データファイル内のMS1スペクトルから検出されたすぺてのペプチドのプリカーサー同位体クロマトグラムを抽出するようにSkylineを設定し、結果をSkylineで調べ始めます。19ページ)

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* - Skyline v20.2より導入。 v21.2にて更新。




併発反応モニタリング(PRM)


ここでは、併発反応モニタリング(PRM)の方法について、低分解の質量分析装置であるThermoのLTQと高分解能の質量分析装置であるAgilent 6520 Q-TOFのデータを使って学んでいきます。分解能の異なる装置での測定によるプリカーサーおよびフラグメントイオンを利用したペプチドの定量分析における選択性と感度の違いを理解することができるでしょう。クロマトグラフィーをベースとした定量プロテオミクスを実施する中で、Skylineが提供するさまざまな機能を活用することにより、質量分析データの理解と活用のための新しい方法を発見してください。(39ページ)

[ダウンロード]

* - Skyline v1.2より導入。 v1.4、v2.5、v20.1、v21.1にて更新。

私たちのJournal of Proteome Research誌の論文もご覧ください。(こちらを引用下さい)
Label-Free Quantitation of Protein Modifications by Pseudo-Selected Reaction Monitoring with Internal Reference Peptides
[要約]




DIA、データ非依存性解析


ここでは、Data-independent acquisition(DIA、データ非依存性解析)について、同一装置で取得したDIAとDDAの測定データを利用していく方法で学んでいきます。まずは、SkylineでDIAデータを処理するための「Isolationスキーム」(DIAでのプリカーサーイオンのウィンドウ幅)の設定を行い、メソッドへエキスポートします。また、実験で使用するスペクトルライブラリをDDAのデータから、DIAの測定データの取得前に作成しておきます。そして、そのスペクトルライブラリからターゲットタンパク質を分析するためのペプチドやトランジションを選択します。そして、関連するDIAのデータをSkylineにインポートし、解析することで、DIAでの作業を始めるための基本的な流れを習熟していきます。 (43 ページ)

[ダウンロード]

* - Skyline v2.6にて導入。 v21.1で更新




SWATHデータの分析


Navarro, Nature Biotech 2016のベンチマークとなる論文に基づいて、装置用に作成された有機体3種の混合データセットを使用し、Q ExactiveまたはTripleTOF装置のいずれかより取得したデータ非依存性取得(DIA)データを利用する実務経験を積みます。保持時間校正向けの自動iRT校正でDDAデータからスペクトルライブラリと、ペプチドピーク検出のmProphet学習モデルを構築するDIAには、ペプチド検索のインポートウィザードを使用します。保持時間、ピーク領域、質量精度、CVを含むSkyline概要プロットの豊富なコレクションを使用してデータ品質を評価します。最後に、グループ比較を実行し、各有機体で予想される比率をデータがうまく取得できたかを評価します。 (35ページ)

[QEをダウンロード] [TTOFをダウンロード]



* - v20.1にて導入。 v21.1で更新。

2020年4月7日にSkylineチームが作成した ウェビナー#18: SkylineにおけるDIA/SWATHデータ解析 を再訪は、最新資料のライブプレゼンテーションです。
[ウェビナーウェビナー]

2017年1月25日にSkylineチームが作成した ウェビナー#14: Skylineを使用した大規模DIAでは、初めてDIAウェビナーを作成してから28か月間で開発された追加の研究とワークフローについて説明しています。
[ウェビナーウェビナー]

2017年4月4日にSkylineチームが作成した ウェビナー#15: Skylineを使用した大規模DIAの最適化では、新たに追加されたデータセットと新規の装置タイプを使用した作業により得られた追加の知見について説明します。
[ウェビナーウェビナー]




によるターゲットメタボロミクス解析


ここでは、Skylineによる小分子化合物の解析について学びます。メタボロミクス研究で使用する小分子化合物のトランジションのリストとWaters社のXevo TQSで測定した14個のデータを使いながら、Skylineでどのように解析を行うかを習得していきます。(12ページ)

[ダウンロード]

* - Skyline v3.1にて導入。v19.1、v20.1で更新。

2015年2月10日にSkylineチームが作成した ウェビナー#4: Skylineターゲットメソッドの編集では、小分子サポートの先行情報をお伝えします。

[ウェビナー]]

2017年11月7日にSkylineチームが作成したウェビナー#16: Skylineの小分子研究サポートに関する新しい資料を紹介します。

[ウェビナー]

このMSACL 2015ポスターを読み、Skylineによる小分子の定量化の詳細をご確認 ください。




小分子メソッド開発とCE最適化


唯一のプリカーサーm/z、プロダクトイオンm/z、そして衝突エネルギーの値のみが指定されている文献引用から、安定同位体標識の小分子をターゲットとするSkylineドキュメントを作成する方法を学びます。また、Sciex製Triple QuadによるCE初期値を用いたWaters製Xevo TQ-Sの複数の繰り返し測定データセットをインポートすることで、小分子の保持時間スケジュール設定と衝突エネルギーの最適化を実施します。ターゲットプロテオミクス用に当初作成されたSkylineの多くの既存機能が、現在では非プロテオミクス小分子データにいかに適用されているかを学びます。(39ページ)

[ダウンロード]



* - 元はSkyline 4.1にて導入。v19.1、v20.1で更新。

2015年2月10日にSkylineチームが作成した ウェビナー#4: Skylineターゲットメソッドの編集では、小分子サポートの先行情報をお伝えします。

[ウェビナー]]

2017年11月7日にSkylineチームが作成したウェビナー#16: Skylineの小分子研究サポートに関する新しい資料を紹介します。

[ウェビナー]

このMSACL 2015ポスターを読み、Skylineによる小分子の定量化の詳細をご確認 ください。




小分子の定量化


プリカーサーイオン化学式および付加物、そしてプロダクトイオンm/z値で指定した小分子をターゲットとするSkylineドキュメントの作成方法を学びます。三連四重極でLC-MS/MSを使用して収集された複数の繰り返し測定データセットをインポートし、元はターゲットプロテオミクスに使用するために作成された既存のSkyline機能のいくつを今度は小分子データに適用できるかを理解します。 (28ページ)

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* - 元はSkyline 4.1にて導入。v19.1、v20.1で更新。

2015年2月10日にSkylineチームが作成した ウェビナー#4: Skylineターゲットメソッドの編集では、小分子サポートの先行情報をお伝えします。

[ウェビナー]

2017年11月7日にSkylineチームが作成した ウェビナー#16: Skylineの小分子研究では、小分子サポートに関する新しい資料を紹介します。

[ウェビナー]




絶対定量


実験におけるペプチドの絶対的分子量を推定するために、Skyline校正定量を使用する実務経験を積みます。 (21ページ)

[ダウンロード]



* - Skyline v1.1にて導入。v1.4にて更新。v3.5にて校正機能を更新、v20.1にて更新。

2015年12月1日にSkylineチームが作成したウェビナー#12: Skylineで同位体標識された標準では、この話題に関するもう1つのリソースを紹介します。
[ウェビナー]

2016年4月15日にSkylineチームが作成したウェビナー#13: Skylineの校正定量では、この話題に関するもう1つのリソースを紹介します。
[ウェビナー]

『Nature Methods』に掲載された論文もご覧ください。
[要約]




カスタムレポートとライブレポート


Skylineドキュメントから広範な値の表示、編集、エクスポートを行なうことのできるSkylineのカスタムライブレポートを使用し、実務作業経験を積みます。これらのレポートはExcelでの使用に最適であり、またSkylineを用いた装置出力処理後、ディープ統計分析を行なうためにカスタムコードを使用してR、Matlab、Java、C++、その他の言語で書かれています。またSkyline結果グリッドビューを使用するこれらの値へのアクセスの取得方法、Skylineでデータの検査中にカスタム注釈の追加方法について学びます。このチュートリアルに従うことで、Skylineを使用して実現可能な実験の範囲が格段に広がります。 (35ページ)

[ダウンロード]



* - Skyline v0.6より導入。v1.4、v2.5、v20.2にて更新。




iRT保持時間予測


ここでは、スケジュール化された測定やピーク同定のための保持時間予測を行うためのiRT値について学んでいきます。校正された実測のペプチドの保持時間をライブラリーに蓄積することで、将来的に活用することができます。このチュートリアルでは、iRTカリキュレータによる校正方法や、Biognosys社により提案されているiRT-C18というキャリブレーションについて、iRT-Kitのペプチド標準品を用いて詳細に学んでいきます。さらに、SRMの測定データやスペクトルライブラリ、また、探索実験におけるMS1スキャンの測定データから得られたクロマトグラムピークからもiRT値を校正していきます。さらに、新しく設定したグラジエント条件で、新しいカラムを使用してスケジュール化したSRM測定をする際の、iRT値の再校正の方法も学習していきます。また、これらを通じて、iRT値に基づいて、保持時間を正確に予測することにより、クロマトグラムのピーク同定における信頼性が向上することもわかるでしょう。(37ページ)

[ダウンロード]

* - Skyline v1.2より導入。 v1.4、v20.1にて更新。

2015年5月12日にSkylineチームが作成したウェビナー#7: SkylineのiRT保持時間予測では、SkylineにおけるiRT保持時間の正規化とライブラリー構築のコンセプトの詳細が学べるもう1つのリソースを紹介します。
[ウェビナー]

2017年1月25日にSkylineチームが作成したウェビナー#15: Skylineを使用した大規模DIAでは、最新の高度なDIAワークフローと大規模データセットの使用について説明します。ウェビナー#14でも、メソッド開発へのiRT統合について言及しています。
[ウェビナー]

私たちのProteomics誌の論文もご覧ください。(こちらを引用下さい)
Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides
[要約]